軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)原理:
細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。
由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱 ，傳代細(xì)胞系強(qiáng);二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng);正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系， 做克隆形成率測(cè)定時(shí) ，接種細(xì)胞定要分散成單細(xì)胞暴液,直接接種在碟皿中，持續(xù)一周,隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。
軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)基本步驟:
(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1x106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度信數(shù)稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液,高壓滅菌后，維持在40°C中不會(huì)凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基(含有2x抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混臺(tái)液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7-10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2 xDMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后,再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37C 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10-14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。
軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不直超過(guò)40°C。接種細(xì)胞的密度 每平方厘來(lái)不超過(guò)35個(gè)，一股6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。